蛋白表達(dá)的測(cè)定是分子生物學(xué)研究中的重要環(huán)節(jié)，其使用步驟會(huì)因所選方法的不同而有所差異。
 

　　1.樣品制備
 

　　-取樣與均質(zhì)化：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選取合適的生物樣本(如細(xì)胞、組織或培養(yǎng)液上清)，通過(guò)離心、研磨等方式獲得均勻的裂解物。若涉及分泌型蛋白，需分離上清以避免胞內(nèi)雜質(zhì)干擾。
 

　　-定量標(biāo)準(zhǔn)化：使用BCA法或其他蛋白定量試劑盒確定總蛋白濃度，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)加樣量的一致性。
 

　　2.電泳分離(以SDS-PAGE為例)
 

　　-凝膠配制：根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，加入SDS使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷并展開(kāi)為線性結(jié)構(gòu)。
 

　　-上樣與跑膠：將處理好的樣品加載至凝膠孔中，在恒定電流下進(jìn)行電泳，實(shí)現(xiàn)按分子量大小的區(qū)帶分離。
 

　　-轉(zhuǎn)膜：采用濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF/NC膜上，便于后續(xù)檢測(cè)。
 

　　3.免疫檢測(cè)(Western Blot流程)
 

　　-封閉：用脫脂奶粉或牛血清白蛋白溶液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景噪音；
 

　　-抗體孵育：依次加入一抗(針對(duì)目標(biāo)蛋白)、HRP標(biāo)記的二抗，通過(guò)抗原-抗體特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大；
 

　　-顯色成像：使用ECL化學(xué)發(fā)光底物曝光X光片或直接用成像系統(tǒng)采集條帶信息。
 

　　4.數(shù)據(jù)分析
 

　　-定量分析：通過(guò)灰度掃描軟件對(duì)目的條帶與內(nèi)參(如β-actin)進(jìn)行光密度比值計(jì)算，評(píng)估相對(duì)表達(dá)水平；
 

　　-質(zhì)譜驗(yàn)證：對(duì)于復(fù)雜混合物，可切割膠條進(jìn)行質(zhì)譜鑒定以確認(rèn)蛋白身份。
 

　　蛋白表達(dá)的作用原理：
 

　　1.基因克隆與載體構(gòu)建：將目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列插入到特定的表達(dá)載體中，這個(gè)載體通常包含啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控元件以及篩選標(biāo)記。然后，把重組后的質(zhì)粒或其他形式的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。常見(jiàn)的宿主包括細(xì)菌(如大腸桿菌)、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。
 

　　2.轉(zhuǎn)錄過(guò)程：一旦載體進(jìn)入宿主細(xì)胞，目標(biāo)基因會(huì)在啟動(dòng)子的作用下被轉(zhuǎn)錄成mRNA。原核生物中，由于沒(méi)有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎是同時(shí)進(jìn)行的；而在真核生物中，轉(zhuǎn)錄主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，之后mRNA才會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯。
 

　　3.翻譯過(guò)程：在核糖體的作用下，以mRNA為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將遺傳密碼轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，逐步合成多肽鏈，形成具有特定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。
 

　　4.后處理與修飾：某些表達(dá)系統(tǒng)還能對(duì)新生的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后的修飾，比如糖基化、磷酸化等，這些修飾對(duì)于維持蛋白質(zhì)的功能性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠進(jìn)行復(fù)雜的糖基化和其他類(lèi)似的修飾，使得到的蛋白更接近天然狀態(tài)。