（1） 質(zhì)粒的提取 (Tiangen質(zhì)粒提取試劑盒)：

a） 挑菌： 選取培養(yǎng)板中大小中等的單個(gè)菌落， 消毒牙簽接種到10ml搖菌管中， 其中含有卡那霉素的LB約5ml， 37 °C， 220rpm恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

b） 取上述2.0ml培養(yǎng)液， 于常溫下12000 rpm離心1分鐘， 棄上清， 干燥沉淀。

c） 加入250µl溶液P1(配有去RNA酶， 4 °C保存)， 渦旋振蕩， *懸浮細(xì)菌，不能留有沉淀， 否則會(huì)影響裂解。

d） 加入250µl溶液P2， 快速上下顛倒8次， 常溫靜置3分鐘， 可見(jiàn)混合液逐漸變清、 粘稠， 表示已充分裂解。

e） 再加入350 µl溶液Ⅲ， 快速上下顛倒8次， 可見(jiàn)白色絮狀物出現(xiàn)。

f） 常溫12000rpm離心10分鐘， 所得上清液倒入已經(jīng)用BL平衡過(guò)的過(guò)濾柱中，注意不要倒入白色絮狀物沉淀， 靜置3分鐘， 12000 rpm離心1分鐘。

g） 加入500 µl溶液PD， 12000 rpm離心1分鐘。

h） 加入600 µl溶液PW， 12000 rpm離心1分鐘； 此步驟再重復(fù)1次； 棄廢液后空管再次12000 rpm離心2分鐘。

i） 于超凈臺(tái)通風(fēng)干燥， 放置2-5分鐘， 加入33µl已加熱至65 °C的已滅菌的ddH 2 O， 室溫靜置3分鐘， 12000 rpm離心2分鐘， 得到相關(guān)質(zhì)粒DNA， 測(cè)濃度， -20 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

（2） 質(zhì)粒鑒定及保存

取100ng上述提取的質(zhì)粒， 進(jìn)行酶切（反應(yīng)體系見(jiàn)前）， 隨后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳以鑒定（方法同前所述）， 最后將粗略鑒定正確的樣本送至生物技術(shù)公司測(cè)序。 如測(cè)序正確， 用50%滅菌甘油300µl+700µl的菌液， 標(biāo)記于-80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

11） 質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物純化（膠回收）

（1） 瓊脂糖電泳酶切或 PCR 相關(guān)產(chǎn)物。

（2） 在紫外投射反射儀割取含有目的片段的瓊脂糖凝膠片段， 割取要迅速， 以避免紫外線對(duì) DNA 的損傷， 但注意盡量割取目的片段， 減少無(wú)目的片段的凝膠量， 以便提高純化回收效率。

（3） 用天平稱先稱區(qū)空 EP 管重量， 再稱取含有凝膠的 EP 管重量， 計(jì)算得到凝膠重量（mg）， 加入等量體積（µl） Bindingbuffer（如 1 mg=1 μl）。

（4） 將含有凝膠的 EP 管置入 60 °C 恒溫水浴箱中融化凝膠， 持續(xù) 8-10min，間或拿出搖勻， 以確保*凝膠溶解。

（5） 將上述凝膠溶液轉(zhuǎn)移至干凈的純化柱上， 室溫下靜置吸附 3 分鐘。

（6） 將純化柱 12000rpm 離心 1 分鐘， 棄超濾液， 必要時(shí)可將超濾液重新離心1 次可提供純化效率； 再次加入 100µl Binding buffer， 12000rpm 離心 1 分鐘。

（7）加入 700µl Wash buffer （事先已經(jīng)加入無(wú)水乙醇）， 12000 rpm 離心 1 分鐘，棄超濾液； 空管 12000 rpm 離心 2 分鐘。

（8） 純化柱置于 1.5 毫升干凈離心管中， 于超凈臺(tái)通風(fēng)干燥 5 分鐘。

（9） 加入 30µl 已加熱至 65 °C 的已滅菌的 ddH 2 O， 室溫靜置 3 分鐘， 12000 rpm離心 2 分鐘， 得到相應(yīng)的 DNA 片段， 測(cè)濃度， -20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

艾柏森提供質(zhì)粒測(cè)序服務(wù)

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